Q：建议qPCR 实验用几步法？
A：常用 2 步法。需提高扩增特异性，可选用 2 步法或提高退火温度。在扩增效率低， ct 值过大的时候，可以改用 3 步法或延长延伸时间。
Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？
A：有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为 -3--3.5。 R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。（2）扩 增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无 Ct 值。（3）熔解曲线：为单一峰。
Ct 值大于 15 个循环是因为 3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。
Q：11184 的灵敏度极限是?
A：单拷贝
Q：同一基因复孔间熔解曲线 Tm 值有差异？
A：同样的扩增产物也会出现Tm 值有微小差异，一般差异在 1 度以内都可以接受。
Q：为什么稀释了模板CT 值反而变小了？
A：一般 CT 值与模板起始浓度呈负相关，浓度越高，CT 值越小。但也有很多特殊情况， 比如体系中存在抑制物或是模板不纯，这时候稀释模板反而能使 CT 值变低。
Q：内参CT 值小于 20，目的基因均大于 30，怎么办？
A:可能是目的基因为低丰度表达基因导致。建议：a）换用内参；b）换引物
Q：为什么扩增曲线杂乱且不连续？
A：可能原因是 ROX 添加不当。确认参比染料ROX 是否添加正确。
Q：模板用量X 是多少？常用的量是多少？
A：(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5-10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在 20-30 之间的最佳上样量。
(2)常用的量是逆转录 500-1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验。
Q：qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？
A：a)有效性要满足三个条件：
（1）标准曲线：扩增效率范围:90-110%，对应斜率为 -3--3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。
（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。
（3） 熔解曲线：为单一峰。
b)3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。
Q：Rox 的作用？
A:ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。
Q: 为什么扩增产物跑胶会有拖尾的现象？
A: 试剂中含有稳定性成分，本身不参与任何反应，但在电泳胶上面会表现出弥散状，不建议跑完后再电泳。
Q: 试剂比较粘稠，容易产生气泡，如何避免？
A: 可以先混合大体系，再分别加到离心管里面，最后加模板；
枪头加样不要把空气打进去，二档吸样，一档打样品；缓慢推出液体，不要吹打；沿着壁打入到孔内；
另外配置完后，如果还有气泡，离心PCR管去除。如果是96孔板，移液完后轻轻敲96孔板。
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