A：应避免选择克隆位点上下游 50 bp 内有重复序列的区域。并且克隆位点上下游 20 bp区域内 GC 含量尽量在 40%-60%范围内。

Q：载体线性化的方式有哪些？

A：酶切（包括单酶切和双酶切）或反向PCR，建议双酶切。

Q：线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例？

A：载体使用量应大于 0.01 pmol，推荐使用量 0.03 pmol；克隆载体与目的片段摩尔比应在 2:1-1:5 范围内，最适为 1:2-1:3，超过范围可能会影响克隆效率。

Q：线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗？

A：会。线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，会产生较高的假阳性或抑制反应。建议割胶回收纯化产物。

Q：试剂盒里面的载体可以用吗？抗性是什么？同源重组克隆试剂盒会提供终载体吗？

A:可以用，线性化载体是通过反向PCR 方式制备。氨苄抗性。不提供终载体。

Q：最小可以插入多小的片段？最大多少？

A：最小建议 100bp 以上，过短的片段可能会被核酸外切酶完全切除掉。最大 10kb， 一般片段越大，难度系数更高些。

Q：一步法快速克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗？是否必须搭配翊圣的感受态细胞？是否可以用电转的方法？

A：不是必需搭配。推荐使用转化效率为 107 cfu/μg 以上的感受态细胞。如 Yeasen的 DH5α（cat NO. 11802ES），TOP10（cat NO. 11801ES）等。可以电转，但要用电转感受态。