本试剂盒是利用拓扑异构酶（Topoisomerase）高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成，与传统的T4连接酶相比，具有以下优势：1）快速，仅需1-5分钟即可完成连接反应。2）高效，无自连现象，阳性克隆率接近100%，无需设置蓝白斑筛选；3）操作简单，从连接到涂板仅需15-20 min。操作过程省去冰浴、热激和1 h复苏等。4）可连接长达5 kb目的产物。

Q：从质粒上酶切的产物可直接连接 Topo 载体吗？为什么？

A：Topo 载体进行连接反应的时候需要 5`羟基端和 Topo 酶发生反应。PCR 产物 5`羟基端没有磷酸化， 可以直接进行 TOPO 克隆。但是，酶切产物 5`端为磷酸化状态，可以直接进行 TA 克隆的，但是不能进行 Topo 克隆。如果需要，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）进行去磷酸化处理后连接 Topo 载体。

Q：连接反应体系和反应时间以及温度对连接效率的影响大吗？

A：建议反应体系应控制在 10μl 内，体系太小连接会受到影响。如果目的基因浓度太低，建议浓缩之后再连接，以提高连接成功率。插入片段使用量参考说明书。一般 1-2min 即可完成连接反应，若想得到更多克隆，可适当延长至 5min，但不能超过 5min。室温反应即可。

Q：如何选择合适的载体？

A：若 PCR 产物为 Taq 酶扩增则选择 TOPO-TA 克隆载体系列，若 PCR 产物为高保真酶扩增则选择 Blunt 载体系列，Simple 载体不含多克隆位点区，可根据需求在 PCR 扩增时添加自己需要的酶切位点。

Q：若是储存了很久的 PCR 产物还能用来做克隆吗？

A：建议采用新鲜的 PCR 产物会使连接效率更高一些，若是-20℃保存的一周内还可以使用。请避免

PCR 产物的反复冻融和降解。

Q：PCR 扩增产物需要纯化吗？

A：先对 PCR 产物跑胶鉴定，若是 PCR 产物电泳条带单一、浓度较高且无引物二聚体可直接进行连接反应。若是有杂带或引物二聚体建议纯化之后再进行连接反应。