本试剂盒是利用拓扑异构酶(Topoisomerase)高效快速连接DNA片段的原理进一步研发而成，与传统的T4连接酶相比，具有以下优势：

1）快速，仅需 1-5 min即可完成连接反应。

2）高效，无自连，阳性克隆率接近100%，无需设置蓝白斑筛选；

3）操作简单，从连接到涂板仅需 15-20 min。操作过程省去冰浴、热激和1 h复苏。

4）可连接长达5 kb目的产物；

5）Hieff Clone^® Zero TOPO-TA Simple Cloning Kit不含多克隆酶切位点(MCS)，在引入后续酶切位点进行酶切操作时，不会受到MCS位点的影响，从而增加酶切效率以及克隆成功率。

Q：TOPO 克隆和一步法克隆应用方面的区别？

A：TOPO 克隆主要用于构建克隆载体，应用于目的基因的复制，保存或测序等；一步法克隆可用于

构建克隆或表达载体，点突变，多片段克隆等。

Q：TOPO 载体含有启动子吗？TOPO 载体是什么抗性？

A：没有启动子，因为TOPO 载体是克隆载体。氨苄抗性。

Q：载体能否提供全序列？客户实验能否用客户自己的载体？

A：a）可以提供全序列。

b）不能用客户的载体，试剂盒中已带有偶联TOPO 异构酶的载体。

Q：PCR 产物是否需要特殊处理？

A：无需特殊处理，但为了保证阳性率，最好进行胶回收纯化。

Q：平末端和 TA 克隆试剂盒的 Enhancer 能混合使用吗？

A：不建议混合使用。

Q：反应过夜可以吗？

A：不可以，TOPO 异构酶具有限制性内切酶活性，时间过长会重新切割重组质粒，建议反应时间不

超过 5min。

Q：TOPO 载体最大可插入多大片段？能否插入多个片段？

A：a）验证过 5kb，一般片段越大，难度系数也会更高些。b）不能插入多片段，只能单个片段的插入。

Q：全式金的 TOPO 克隆试剂盒和翊圣的区别，可以替代吗？或 Takara 的 T 载体和翊圣 TOPO 克隆试剂盒有什么区别？可以替代吗？

A：都可以替代。

a）①与全式金 TOPO 克隆的区别：a）全式金没有自杀基因，需要蓝白斑筛选，翊圣的有自杀基因， 不需要筛选。②全式金的组分带有通用引物和感受态细胞，翊圣不含有，客户需额外准备。

b）与 Takara T 载体的区别：原理不一样，Takara 试剂盒利用的是 T4 连接酶，翊圣是 TOPO 异构酶，TOPO 异构酶更快更高效。