Q:如何获得特定长度的 RNA 呢？

A:可以在插入位点下游选择限制酶切割，切割产生平末端或 5-突出端最好。

Q:T7 转录酶有没有验证过除 37℃外其他温度下的活性？

A:37℃和 42℃转录能力无差别，但是不耐 50℃。

Q:转录产物有杂带（偏大）是什么原因？

A:模板线性化不完全，导致转录停不下来，所以转录条带会偏大，出现杂带。

Q: T7酶的保真性能怎么样？有没有开展相关测试？

A: 我们的T7酶测试了相对保真度，与Thermo的保真度差不多，大概万分之四的突变率。目前野生型的T7保真度都差不多，基本能满足客户的需求。现项目中没有更高保真度T7的开发计划。

Q: 使用T7聚合酶的产量是使用LiCl纯化后进行测定的吗？有没有A260/280和A260/230的数据？

A: 是通过LiCl纯化后进行测定的，我们有记录过相关数据A260/280大概比值再在2.0-2.1之间；使用我们的羧基磁珠纯化也基本在这个范围以内。具体数据可以整理之后再分享。

Q: 采用T7聚合酶转录的时候，有没有什么办法，减少polyA尾多转录的问题？

A: 这一情况是T7反应体系的自身特性，无法完全避免。根据相关的文献，控制mRNA自延长的思路主要还是两方面：

①对模板3'末端上游序列进行优化；

②控制IVT产量，高产量下自我延伸的几率会更高。