9°N DNA Ligase为高温连接酶，它能催化与同一互补靶DNA链杂交的两条相邻寡核苷酸链的5´-磷酸和3´-羟基之间形成磷酸二酯键。该催化反应只有当两条寡核苷酸链与互补靶DNA完全配对，且两条寡核苷酸链之间没有间隙的条件下才会发生。因此可以用于检测单碱基替换。该酶以ATP作为辅因子，在45-70℃区间内均有活性。