萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）是一种分子量约为61 kDa的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，能够催化萤光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在氧化的过程中会发出波长为560 nm左右的生物萤光。海肾萤光素酶（Renilla luciferase）是一种分子量约为36 kDa的蛋白，在氧气存在的条件下，可以催化腔肠素（coelenterazine）氧化成coelenteramide，在氧化的过程中会发出波长为480nm左右的生物萤光。两种生物萤光都可通过化学发光仪进行测定。检测原理如图所示：

 
图1：萤火虫和海肾萤光素酶检测原理图

通常将目的基因的5´UTR或启动子克隆至Firefly Luciferase的上游，或3´UTR克隆至Firefly Luciferase的下游，通过检测萤火虫萤光素酶的量来检测启动子或调控元件的转录调控作用。Renilla Luciferase作为内参，来消除细胞数量、转染效率等的差异。Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit首先以萤光素为底物来检测萤火虫萤光素酶报告基因的活性，之后在淬灭该萤光反应的同时，以腔肠素为底物检测海肾萤光素酶报告基因的活性。该试剂盒具有灵敏度高的特点。

Q：细胞裂解之后的裂解液能否在-80℃保存？

A：可保存在-80℃，基本与蛋白的保存方法类似。裂解后的样本可在 -80 ℃保存半年，-20 ℃保存一个月。

Q：双荧光素酶报告基因检测试剂盒中的两个底物是否需要避光的？

A：这两个底物操作过程中不需要严格避光。保存的时候避光保存，更重要的保存条件是低温，尤其是腔肠素，推荐-80℃保存。

Q：双荧光素酶报告基因载体共转染时比例该如何进行优化与调整？

A：比例：根据具体实验情况进行调整。建议做预实验：如海参载体与萤火虫载体比例分别用 1:10、1:20、1:50、1:100。萤火虫荧光素酶检测发光值大于海参荧光素酶发光值的比例比较好。

Q：海肾和萤火虫是在同一个孔里面检测吗？萤火虫的萤光不会影响海肾的萤光吗？能否分开检测呢？

A:同一个孔里检测。不会相互影响，我们的海肾荧光素酶底物中有淬灭萤火虫荧光值的物质。可以分开检测，但是在一个孔里检测会更加准确。

Q：使用的是promega的仪器进行检测，发现海肾的本底值偏高很多，是为什么呢？

A：我们的产品与promega的仪器不适配，会导致本底值偏高。建议使用酶标仪检测。

Q:检测萤火虫荧光素酶，酶标仪使用什么样的板子呢？

A：白色不透明的酶标板。

Q：裂解液不够用了，怎么办呢？

A：10ml PBS里加入0.3ml Triton。

Q：如遇使用细胞裂解液对细胞样本裂解后，后续使用BCA方法检测蛋白存在背景较高的情况该如何处理？

A：对细胞裂解样本进行5倍稀释后再检测。

Q: 为啥11402试剂盒里要裂解细胞，40901这个单独的底物不需要？

A: 1、荧光素酶是表达在细胞内，是一种不存在于人类物种的水解酶（所以本底很低），它不能透膜。荧光素酶的底物是环状小分子，是疏水的，因而可以透膜的，因此只要存在荧光素酶表达，那必然是外源的，那么将底物加到细胞培养基中或打到体内均能得到信号。

2、报告基因体外检测需要细胞裂解是为了避免细胞转染异质性、底物渗透不均匀和信号不均一而强行匀质化的做法。体外报告基因检测是一个定量且灵敏度很高的实验，报告基因检测需要ATP和氧气的存在，裂解细胞是需要把表达的荧光素酶完全释放出来，能够有更好的反应，因为细胞内的氧气含量有限，如果不裂解，会导致信号一定程度的降低（有的裂解液也做了一些优化，比如额外加了ATP以提高信号等）。因此报告基因体外检测裂解细胞能够有更好的信号；

3、活体成像，检测仪器功率大，能够透过皮肤，细胞，有更强的穿透力，因此可以不用裂解细胞就可以检测到很强的荧光信号，还有就是活体成像检测比较糙，精准度都是相对的。

Q：当海肾作为主报告基因时检测的顺序是否可以调整呢？

A：不可以调整。在该检测试剂盒中，其中组分B萤火虫萤光素酶缓冲液无论对于萤火虫荧光素酶还是海肾荧光素酶的检测都至关重要，海肾萤光素酶的最适反应环境需要有组分B的存在，否则会出现海肾荧光素酶检测值非常低的情况。

当仅需要检测海肾荧光素酶时，也需要加入组分B，这样才能保证最适反应环境检测到正确的结果。