Q：可以进行蓝白斑筛选吗？

A：不可以，不包含用于蓝白斑筛选的β-半乳糖系统。TOPO克隆主打的就是快速，阳性率高，所以一般不需要进行蓝白斑筛选。

Q: 从质粒上酶切的产物可直接连接Topo载体吗？为什么？

A: 不可以。Topo载体进行连接反应的时候需要5'羟基端和Topo酶发生反应。PCR产物5'羟基端没有磷酸化，可以直接进行TOPO克隆。但是，酶切产物5'端为磷酸化状态，可以直接进行TA克隆的，但是不能进行Topo克隆。如果需要，可以用小牛肠碱性磷酸酶（10321ES）进行去磷酸化处理后连接Topo载体。

Q: 连接反应体系和反应时间以及温度对连接效率的影响大吗？

A: 建议反应体系应控制在10 μL内，体系太小连接会受到影响。如果目的基因浓度太低，建议浓缩之后再连接，以提高连接成功率。插入片段使用量参考说明书。连接反应不可于冰上进行。室温（20-37℃）下孵育时，建议孵育时间不超过5 min，如果PCR产物浓度较低或者片段较长，则可以适当延长孵育时间，不宜超过15 min（推荐使用25℃，PCR仪控温）。

Q: 若是储存了很久的PCR产物还能用来做克隆吗？
A: 建议采用新鲜的PCR产物会使连接效率更高一些，若是-20℃保存的一周内还可以使用。请避免PCR产物的反复冻融和降解。

Q: PCR扩增产物需要纯化吗？
A: 先对PCR产物跑胶鉴定，若是PCR产物电泳条带单一、浓度较高且无引物二聚体可直接进行连接反应。若是有杂带或引物二聚体建议纯化之后再进行连接反应。

Q：这个试剂盒中的载体是什么抗性的？

A：氨苄抗性。

Q:板子上需要加的氨苄抗生素浓度是多大的？

A：100ug/ml。