真核生物中mRNA经转录后修饰在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性，可将7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp）连接到RNA的5'末端（m7Gppp5'N）。牛痘病毒加帽酶，在合适浓度的加帽缓冲液（Capping buffer），鸟苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在条件下，能够在一个小时之内对RNA进行加帽，并且保证正确的方向。

本品以无菌液体形式提供，可应用于体内/体外翻译前mRNA的加帽反应或mRNA的5'末端标记反应。

Q: 酶法加帽中先升温再降温的目的是什么？在放大生产时好像很难做到先升温再降温。

A: 先升温是为了把RNA二级结构打开，让RNA处于单链状态。如果不进行这步操作的话，会影响加帽的效率。这部分目前的确是工艺生产上的难点。现在有的公司直接在模板序列确定时会对RNA的二级结构作预测，加帽酶只识别mRNA前几个核苷酸，如果确定这部分结构不会产生RNA的二级结构的话，可以不进行加热。

Q: 帽类似物加帽和酶法加帽如何选择？

A: 工业上酶法加帽最常使用的是牛痘病毒加帽酶处理IVT产物可以将其修饰成Cap 0 mRNA，Cap 0结构可以在二氧甲基转移酶（2'O-methyltransferase）的作用下进一步修饰成Cap 1（m7GpppmN）。利用酶法加帽，加帽效率可以达到95%以上。共转录加帽法操作简便，但由于GTP会竞争帽状二聚体，因此该方法加帽率低一些；两种方式各有优缺点。

Q: 加帽优化的方式有哪些？

A: 通过增加VCE的量例如100ul体系加入10ul即100U的酶活，主要是增强VCE的甲基转移酶活性，也可以通过增加SAM（0.5mmol）增强鸟苷转移活性，增加加帽率。例如我们的新款单链加帽酶，它的加帽率显著提升，就是鸟苷转移活性比传统的更好，对于传统VCE，小亚基D12容易沉淀形成聚合物，纯化时容易损失，所以成本更贵，批次不能控制。

Q: 对于一些没有加上帽子的mRNA，会对后续实验比如说做生物制剂等有什么影响？

A: 目前行业对这一块的没有做针对性的去除，行业里面主要是看加帽效率的多少，目前做的比较好的加帽率在80%以上，当然肯定是越高越好了。这个还没有一个绝对的标准。

对于合成之后的mRNA，可以用纯化的方式处理，比如康*的一步膜包，极大的减少了纯化工艺，传统用Oligo d（T）的柱子做纯化，效果好可以回收率70-80%；效果差40-50%，也可以多加一步疏水柱在oligo dT后。

Q: 共转录加帽和两步法加帽对于模板的起始位点的要求？

A: 共转录要求对于模板的起始位点要求必须是 AGG* 开头

两步法对于位点无要求，但我司目前产品对于AGGG起始位点的产量最高，主要是T7酶的偏好性导致。