Q:DNA 文库构建方法的选择：为什么酶切法建库如此备受青睐？

A:酶切法构建DNA 文库，相较于传统的超声法和转座酶法具有以下优势：

无偏好片段化酶：具有稳定的片段化效果，无需复杂的机械片段化过程。酶切产物片段大小同样本类型、Input DNA 量和GC 含量等均无相关性，仅与酶切时间有关。

建库流程精简：一步完成片段化/末端修复/加A ，片段化/末端修复/加 A （30min）-接头连接（15min）-纯化/分选（30min）-文库扩增（15min）-纯化分选（30min），常规建库预计耗时约 2h，PCR-free 建库预计耗时 1h。

宽泛的样本投入范围：相比较固定投入量，固定酶切时间的TN5 建库，酶切法建库适用 500 pg-1 μg，满足个性化建库。

Q: OnePot/OnePot II 对应竞品是什么？

A: 目前市场上包含片段化酶的试剂盒都可以认为是竞品。目前国外主要有 KAPA Hyper plus(KK8510-8515) 、 NEB(E7805S/L  和  E6177) 、 QIAGEN （ 180473  和 180475 ） 、

Lucigen(15012,15096)；国内主要是诺唯赞（ND 617）、康为世纪（CW2813S/M）、天根

（NG101-01/02）、开泰生物（AT4107)；

Q: 酶切法建库试剂盒的应用是什么？

A: 全基因组测序（含PCR-free 文库构建）、全外显子测序、靶向捕获测序、宏基因组测序等。适合样本类型是 gDNA、cDNA 和高质量的FFPE 样本等，不适合 cfDNA。

Q: 酶切法建库试剂盒是否适合甲基化测序？

A: 不推荐甲基化样本，可以推荐文库扩增模块 12620ES24/96。Q: 酶切法建库试剂盒是否适用于 Ion Torrent 平台？

A：不推荐，接头不匹配，仅适用于 Illumina 平台。但试剂盒的酶切模块 12609 和连接模块12607 可推荐。

Q：片段化模块酶是内切酶还是外切酶？单酶还是混合酶？能否用于其他应用？

A: 片段化酶是随机内切酶，单酶。初始投入量范围 500pg-100 ng，经过 42℃-15min, 可将 DNA 酶切为 150-550 bp 的长度。但酶切后的片段是粘性末端，后续需要进行末端修复。

Q: 酶切法建库试剂盒针对哪些样本建库效果比较好？

A：OnePot/OnePot II DNA 建库试剂盒针对基因组DNA 和 cDNA 均可获得高产高质的文库。

Q: 酶切法建库，质量如何控制？

A: 1）文库浓度检测，qubit 法或 qPCR ；2）文库长度检测，琼脂糖凝胶电泳测定；3）文库质量鉴定，Agilent 2100/2200；4）文库大小分布、引物二聚体和过扩增产物的缺失，应通过电泳方法进行确认。

Q: 12209 整体建库时间多长？

A：建库流程：片段化/末端修复/加 A  （40min）-接头连接（15min）-纯化/分选（30min）。预计耗时约 1.5h。

Q: 使用酶切法建库试剂盒时，input DNA 是否可溶解在含 EDTA 的溶液里？

Q: 片段化和末端修复后的 DNA 可以存放 4 度吗？

A：片段化、末端修复的 DNA 可以保存在 4 度数小时，但过夜储存可能导致部分DNA 的降解。

Q: 连接 buffer 比较粘稠，如果不混匀会造成什么影响？

A：连接反应混合不当，可能导致文库产量低。为了保证合适的混合，反应可以上下颠倒 10 次，或者漩涡 3 秒。

Q:末修/加 A 温度里，30℃和 72℃分别指什么？

A：30℃是酶切和末端修复的温度，72℃会让酶切和末修的酶失活，同时加A，因为加 A 是用的 Taq 酶，它的延伸温度是 72℃。现在我们也改成 65℃了，因为条件更温和效果更好。NEB的加 A 用的是 Klenow 酶，所以他们的加 A 温度是 65℃。现在 Klenow 酶已经过时了，基本不太用了。