Q1：菌悬液要怎么制备？

A：离心去除培养基，收集样本细菌，用 0.85% NaCl 溶液洗涤细胞 3 次（必须充分洗涤以去除培养基，残余的培养基会影响染色效果；不要用 PBS 等磷酸盐缓冲液洗涤，会影响染色效果）。 然后用 0.85% NaCl 溶液制备细胞悬液。

Q：说明书上写的是一个视野可以看到两种颜色，而我同一激发光为什么看不到两种颜色，分开激发就可以，为什么？

A： 有些显微镜是长通滤片，是可以观察到两种荧光；有的显微镜是短通滤片，不能同时观察到两种荧光的。若客户显微镜为短通道的滤片，建议客户分开激发和观察。

Q：两个染料受酯酶的影响吗？

A：不受

Q：说明书上写DMAO染色活细菌和死细菌于荧光显微镜或共聚焦显微镜下呈现绿色荧光，EthD-III染色膜受损的死细菌呈现红色荧光，那实际染色结果会是怎样的呢？

A：DMAO为膜透过性核酸染料可染色活细菌的DNA，其结合DNA的原理不能明确；EthD-III不具膜透过性仅可染色死细菌DNA，该染料为DNA插入型染料，具AT碱基偏好性（参考文献PMID:9016307）。在实际染色结果中会出现这样两种情况，且以下两种结果均为正常结果，原因是一方面染料结合DNA的情况，另一方面因细菌在染色液中的布朗运动：

1、红色荧光和绿色荧光出现共定位

在使用该试剂已发表的文献中参考PMID:  34161080，呈现红绿荧光共定位结果，如下图所示：

2、死细菌为红色荧光，活细菌及不健康细菌为绿色荧光，红色荧光和绿色荧光未呈现共定位：

Q：当用于染色细菌在共聚焦皿形成生物膜时，加入的染色液是否需要去除以及是否需要PBS buffer清洗？

A：染色液可以去除；可不进行PBS 清洗。