Q: 模板线性化的酶切位点大多采用BspQI，bsaI，主要是因为什么原因呢？我看它们都属于IIS型限制性内切酶，这个具体有什么影响吗？

A: mRNA体外转录模板制备方面，限制性内切酶的选择主要基于以下因素：

①切口处应该是5´ 突出末端或者平末端。3´ 突出末端的存在会增加从模板体外转录（IVT）产生的假副产物；

②酶切位点识别序列尽可能长；识别序列越长，该序列出现在基因片段中的可能性就越小；

③IIS 型内切酶是用于疫苗开发中质粒线性化的首选酶，因为它们的切割位点在识别序列之外，可以确保所设计的 poly(A) 尾的完整性。使用 IIS 型内切酶线性化后的 DNA 模板上不会留下“疤痕”，IVT 过程中也不会添加不需要的核苷酸。

④内切酶符合医药生产级别要求（GMP，无动物源性成分等

目前大部分mRNA开发项目，特别是疫苗项目，质粒线性化的内切酶选择还是BspQI、BsaI、XbaI这三种，其中BspQI应用频率最高；估计和国外以往设计的质粒序列有一定关系；当然也不是只能选这些酶，我们也遇到过使用其他酶做线性化的。