Lambda核酸外切酶来源于lambda噬菌体，作用于双链DNA，沿5'→3' 方向逐步切去5' 单核苷酸。最适底物是5' 磷酸化的双链DNA，也能缓慢降解单链 DNA 和非磷酸化双链DNA底物。其中，降解非磷酸化双链DNA，单链DNA底物的效率只有磷酸化双链DNA的5%，1%。另外，该酶不能从DNA的切刻或缺口处起始消化。