Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR是Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 的升级版即用型预混液，与前代Hifair® Ⅲ Reverse Transcriptase相比，本产品具有更强的残留物耐抑制性、更快的反转录速度以及更高的反转录产量。Hifair® AdvanceFast SuperMix含有反转录反应所需的所有组分，可耐受高达65℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的反转录，实验时仅需加入RNA模板和RNase-free H₂O即可进行反转录反应。

本产品反转录产物适用于qPCR，不适用于后续基因克隆等长片段扩增，若有需求，推荐使用翌圣Hifair® AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat#11149ES、Cat#11150ES)进行高效反转录。

1. 反转录时是否需要加入额外的引物？

该产品后续用于常见RNA的qPCR，在反转录预混液中已添加一定比例的随机引物N6和Oligo dT，不需要加额外的引物。若后续进行小RNA或者环状RNA等特殊RNA的qPCR或长片段PCR，建议使用引物分开的反转录试剂盒11139ES或11149ES。

2. 用之前如何混匀试剂？

针对分子酶试剂，上下颠倒混匀后，轻微离心即可。不建议剧烈震荡混匀。

3. 11155ES能够兼容的RNA投入量范围？

11155ES可以兼容10 pg-5 μg的RNA投入量。但是过高的RNA投入量不一定能使Ct值更加靠前，过高的自提RNA投入随之带来的还有残留的其他成分，该抑制成分留在反转录产物中可能会抑制后续qPCR反应，出现Ct值变大或者曲线抖动或者沉淀产物，最终还是要稀释cDNA使用以达到最终结果。

4. 可否选用更长的反转录时间？

不建议选用更长的反转录时间，选用更长时间可能会导致Ct值延后，建议采用说明书建议的程序。

5. 反转录完成后，是否可以长时间置于PCR仪器中？

针对PCR仪器要做好设置，建议在85℃灭活后，设置4℃ 无穷时间∞，以防反应完成后，忘记取出，PCR上百度热盖通过热传导使产物处于高温加热状态。

6. 反转录完成后，需要通过浓度测定，将浓度调整至一定水平再进行荧光定量PCR么？

不需要。反转录产物通常是一个混合物，除了cDNA产物外，还有残余的RNA、蛋白、盐离子、dNTP等等，其中dNTP对于微量分光光度计的测定干扰大，最终对产物测定得到的数值不是产物的浓度。等量水平已在反转录前控制加入等质量的RNA环节中完成了。

7. 反转录完成后，产物忘记及时使用且并未放回冰箱，是否会对实验有影响？

该产品的产物经测试可在常温中放置一周且无影响。故可以继续使用完成后续实验。

8. 试剂打开后，若未用完，是否可以放在4℃环境中？

打开后，确保试剂未受到枪头交叉污染情况下，可放在4℃中，但建议尽量于2周内用完。

9. 后续荧光定量PCR时，搭配该试剂，建议选用哪款？

建议搭配11188-11190ES。